🩸 Reconstrucción vascular 3D + interacción microglía-vaso

Metodología en una línea: los vasos se segmentaron con umbral de histéresis (débil/fuerte) calculado por bloques de profundidad de 30 µm —porque la señal cae ~30× entre la superficie y el fondo—, limitado a los primeros 83 µm (bajo eso solo hay autofluorescencia de RPE/coroides, no retina neural). Sobre la máscara 3D resultante se calculó la línea central (esqueleto) y el mapa de distancias euclidianas 3D (respetando que el vóxel mide 0.57×0.57×0.33 µm). Cada microglía de la reconstrucción CD68 se re-segmentó con su umbral propio y se midió contra ese mapa.

Cómo leerlos: el volumen vascular es la suma de todos los vóxeles segmentados como vaso (≈1% del tejido es lo esperado en retina). El esqueleto es la longitud total de las líneas centrales de todos los vasos — equivale a "cuántos milímetros de cañería" hay en este campo de 291×291 µm. El radio medio sale de medir, en cada punto de la línea central, la distancia a la pared del vaso: valores ~1 µm indican predominio de capilares; los troncos grandes del campo llegan a 3–6 µm.

Vascularización por capa: la retina interna (GCL/IPL) concentra el plexo superficial (2%), mientras INL/OPL aparecen casi avasculares en este marcaje. La señal atribuida a ONL corresponde mayormente a parches del lecho coriocapilar que se cuelan por la inclinación del tejido — ver advertencias al final.

Capa / Z µm: posición del soma en profundidad, asignada a capa retiniana según el perfil de densidad DAPI (GCL/IPL <30 µm · INL 30–43 · OPL 43–47 · ONL 47–83).
Soma→vaso: distancia 3D desde el centro del soma hasta la superficie del vaso más cercano. 0–2 µm = célula perivascular (pegada a la pared).
Tip mín / Tip medio: las "tips" son las puntas de los procesos (extremos del esqueleto de la propia microglía). Tip mín = la punta más cercana a un vaso — si es 0, la célula está tocando el vaso con al menos un proceso; tip medio promedia todas las puntas e indica hacia dónde está desplegado el árbol.
% célula <5 µm: fracción del volumen celular completo que queda a menos de 5 µm de un vaso ("cobertura de contacto"). >60% = célula envolviendo al vaso; 0% = célula sin relación vascular.
CD68: intensidad media del marcador lisosomal/fagocítico dentro del volumen reconstruido (de la corrida CD68) — permite correlacionar activación con posición vascular.

Lectura biológica de esta muestra: las 6 células de GCL/IPL son perivasculares estrictas (soma ≤2.3 µm, todas tocando el vaso con sus procesos, 61–97% de contacto) y concentran el CD68 alto — perfil de macrófago/microglía activada asociada al plexo superficial. Las 3 células profundas viven a 22–40 µm del vaso más cercano pero igual orientan procesos hacia él (tips a 5.6–16 µm), con CD68 bajo — perfil homeostático de vigilancia.

Qué ves: el volumen vascular reconstruido (rojo translúcido) con las 9 microglías reconstruidas en su posición real, giro completo de 360° (~15 s). Colores por morfotipo: verde = Homeostatic (ramificada, vigilancia), naranja = Hypertrophic (activación intermedia), amarillo = Ameboid (activación máxima/fagocítica). Nota cómo las Hypertrophic/Ameboid (CD68 alto) están adosadas a los troncos vasculares del plexo superficial, mientras varias Homeostatic verdes flotan lejos del vaso en la retina profunda.

Qué ves: proyección de máxima intensidad (vista "desde arriba") del canal vascular (rojo) con la línea central del esqueleto en amarillo — cada línea amarilla recorre el eje de un vaso; las mallas amarillas finas son lechos capilares/coriocapilar. Los círculos son los somas de las microglías, coloreados por capa, con su ID y la distancia soma→vaso anotada (ej. "018 (1µm)"). Sirve para ver de un vistazo qué células cuelgan de qué tronco.

Qué ves: el mismo stack pero mirado "de canto": el eje vertical es la profundidad Z en planos (multiplica por 0.33 para µm; 0 = superficie vítrea). La banda brillante inferior es el plexo vascular superficial (0–20 µm), donde viven las células cian. Las líneas blancas marcan los límites de capa estimados con DAPI (GCL, INL, OPL, ONL). Nota que la banda no es plana: el tejido está levemente inclinado/ondulado — por eso la asignación de capas por Z absoluto es aproximada.

Qué ves: para cada célula, la barra roja es la distancia soma→vaso y la naranja la punta de proceso más cercana al vaso. La línea negra parte en el promedio de todas las puntas y sube hasta la punta más lejana — un rango largo indica un árbol muy extendido. La línea punteada gris a 5 µm es el umbral convencional de "contacto vascular": barras bajo esa línea = célula en contacto físico con el vaso. Patrón de la muestra: todas las GCL/IPL bajo el umbral; las tres ONL claramente sobre él, con sus puntas "estirándose" hacia el vaso.